江(jiāng)南大學生物工程學院(yuàn)院(yuàn)長劉龍(lóng)教授在(zài)營養健(jiàn)康食品產(chǎn)業(yè)創新發(fā)展高(gāo)峰論壇上(shàng)發(fā)布了“構(gòu)建細(xì)胞(bāo)工廠高效(xiào)合成嬰配(pèi)奶(nǎi)粉關鍵(jiàn)功(gōng)能營養(yǎng)因子”的主題報告。

劉龍(lóng)教(jiào)授對(duì)嬰(yīng)幼(yòu)兒配(pèi)方奶(nǎi)粉的定義(yì)及(jí)其關(guān)鍵(jiàn)功(gōng)能(néng)營(yíng)養(yǎng)因子簡單介(jiè)紹後(hòu)，重點闡(chǎn)述了通過構(gòu)建細胞工廠高效合成嬰(yīng)配奶粉關(guān)鍵(jiàn)功能(néng)營養因子的最(zuì)新(xīn)研(yán)究進展(zhǎn)。01背景介(jiè)紹

嬰(yīng)幼(yòu)兒(ér)配方奶粉是(shì)以(yǐ)牛乳(rǔ)/大(dà)豆等為主要(yào)原(yuán)料，加(jiā)入適(shì)量的(dí)脂質，寡糖和其他(tā)輔料，調節(jié)成分模(mó)擬母乳加(jiā)工(gōng)而(ér)成的嬰(yīng)幼(yòu)兒(ér)配(pèi)方食品。

母乳中(zhōng)的主要營養成(chéng)分有(yǒu)蛋(dàn)白(bái)質，脂質，碳(tàn)水(shuǐ)化(huà)合物(wù)，維(wéi)生(shēng)素(sù)，礦(kuàng)物質(zhì)以及(jí)其他(tā)各(gè)種生(shēng)物活(huó)性(xìng)物質(zhì)，其(qí)中蛋(dàn)白質(zhì)中的乳鐵蛋白（LF），脂(zhī)質中的甘油三(sān)酯（TAG）以(yǐ)及碳(tàn)水化合(hé)物中的母乳寡糖(táng)可通過細胞工廠(chǎng)進行(háng)高(gāo)效生(shēng)產。

微(wēi)生(shēng)物(wù)細胞工(gōng)廠(chǎng)是指利用微(wēi)生物強大(dà)的生(shēng)物轉(zhuǎn)化(huà)或(huò)合成能力，基(jī)於合(hé)成生物學等(děng)技(jì)術開發(fā)構(gòu)築(zhù)的(dí)能(néng)夠(gòu)進行物(wù)質生產(chǎn)的(dí)人工(gōng)代謝體(tǐ)係。02研(yán)究(jiū)成果01乳鐵蛋白細(xì)胞(bāo)工(gōng)程(chéng)的構建

乳鐵蛋白(bái)(lactoferrin，LF)是(shì)一種(zhǒng)非(fēi)血紅(hóng)素(sù)鐵(tiě)結合糖(táng)蛋白，在(zài)體(tǐ)內行(háng)使(shǐ)轉運鐵(tiě)離(lí)子(zǐ)的作(zuò)用(yòng)；LF也是母乳中(zhōng)的核心(xīn)免疫蛋白(bái)，是(shì)嬰(yīng)幼(yòu)兒(ér)成(chéng)長發(fā)育(yù)中不可(kě)或缺的重要(yào)營養。

將乳(rǔ)鐵(tiě)蛋白(bái)(LF)編(biān)碼(mǎ)基因(yīn)轉入畢(bì)赤酵母(mǔ)中，並(bìng)通過表(biǎo)達分(fēn)子伴侶與(yǔ)促(cù)溶標(biāo)簽輔(fǔ)助(zhù)蛋白折疊，LF搖瓶中(zhōng)產量(liáng)達到537 μg/L，通過(guò)研(yán)究發(fā)現，乳(rǔ)鐵蛋(dàn)白積(jī)聚在內(nèi)質網和(hé)高爾基中(zhōng)，說明蛋白分(fēn)泌(mì)是主(zhǔ)要限(xiàn)製因素。

通過(guò)信(xìn)號肽(tài)篩選(xuǎn)，雜合信號(hào)肽(tài)構建，核糖體蛋(dàn)白(bái)強(qiáng)化，轉(zhuǎn)錄因子過表達等的(dí)優化(huà)後(hòu)，LF搖(yáo)瓶(píng)中產(chǎn)量達到654.5 mg/L。

在3-L發酵(jiào)罐中(zhōng)對(duì)甲(jiǎ)醇誘(yòu)導條(tiáo)件進(jìn)行(háng)優化調(tiáo)控，LF產量達(dá)到5.38 g/L；並且對(duì)純(chún)化(huà)後(hòu)的LF進行生(shēng)理(lǐ)活(huó)性檢(jiǎn)測，當LF濃度達(dá)到(dào)10 mg/L時抑菌(jūn)率為35%，且未(wèi)對(duì)動物(wù)細(xì)胞形態(tài)產生影(yǐng)響。02母(mǔ)乳脂(zhī)質細胞工(gōng)廠的構建

母(mǔ)乳脂(zhī)質(98%-99%為甘油(yóu)三酯(zhǐ)，TAG)是母乳中(zhōng)的第二大固體成分(fēn)，其中(zhōng)約70%的(dí)棕櫚酸(suān)位(wèi)於(yú)Sn-2位(wèi)，不飽(bǎo)和脂肪酸位(wèi)於(yú)Sn-1,3位(如(rú)OPO與(yǔ)OPL)。

在釀酒酵母中(zhōng)通過(guò)脂質合成(chéng)強化，TAG合(hé)成途徑重構及(jí)內質網(wǎng)形(xíng)態調(tiáo)控(kòng)等(děng)策略，TAG含量提(tí)升(shēng)9.4倍(bèi)且OPO占總TAG的(dí)比例(lì)由0%提升至(zhì)1.9%。進一步(bù)通過脂肪(fáng)酸合成酶係改(gǎi)造(zào)，酰基供體比例(lì)優(yōu)化(huà)及(jí)關(guān)鍵基(jī)因表(biǎo)達強(qiáng)化(huà)等策(cè)略(lüè)，OPO占總TAG的比(bǐ)例由(yóu)1.9%提升至12.9%(產量(liáng)為(wéi)1.9 mg/g DCW)。

03母(mǔ)乳(rǔ)寡糖（HMOs）細(xì)胞工廠(chǎng)的構(gòu)建

母(mǔ)乳(rǔ)寡(guǎ)糖(HMOs)是(shì)母(mǔ)乳中僅次於(yú)乳(rǔ)糖和脂質(zhì)的(dí)第三(sān)大固(gù)體(tǐ)成(chéng)分，主要(yào)分(fēn)為岩藻糖(táng)基(jī)化HMOs，乙酰基(jī)化(huà)HMOs和(hé)唾液酸化HMOs三(sān)類(lèi)，具有(yǒu)支持(chí)免疫係(xì)統，消(xiāo)化健(jiàn)康及(jí)大腦發(fā)育(yù)等功能。

劉龍(lóng)教(jiào)授團隊利用底物轉運係統優化，動態(tài)調控(kòng)等合成生物(wù)學(xué)技(jì)術(shù)，能夠(gòu)創製可從頭(tóu)合成2＇-FL，LNnT，LNT，3′-SL，6′-SL和(hé)3-FL的係(xì)列(liè)HMOs細(xì)胞工廠(chǎng)。

其中對岩藻(zǎo)糖基化(huà)HMOs-2′-FL細胞(bāo)工(gōng)廠的構建研究時間(jiān)較(jiào)長(cháng)，研(yán)究比較(jiào)深(shēn)入。

A，岩藻(zǎo)糖基化HMOs：2′-FL細胞(bāo)工(gōng)廠的構建 

以大腸杆菌(E. coli)MG1655菌(jūn)株為底盤(pán)細胞(bāo)，通(tōng)過(guò)合成(chéng)途徑優(yōu)化重(zhòng)構(gòu)，關(guān)鍵酶(méi)的穩(wěn)定性表達(dá)以及輔因(yīn)子供應體係優化(huà)，實現(xiàn)了(liǎo)以(yǐ)葡萄糖(táng)和乳(rǔ)糖為底物的(dí)2′-FL高(gāo)效從頭合(hé)成，3-L發酵罐中(zhōng)的(dí)產(chǎn)量(liáng)與(yǔ)乳(rǔ)糖轉化率(shuài)分別(bié)為(wéi)57.4 g/L與0.79 mol/mol

劉龍教(jiào)授團隊(duì)對(duì)2′-FL的(dí)細(xì)胞工(gōng)廠構(gòu)建研究中，一步一個(gè)腳印(yìn)，逐步深入研究，最(zuì)終(zhōng)達(dá)到的成果(guǒ)是3-L發酵罐中2′-FL的產(chǎn)量與乳糖轉(zhuǎn)化率分別(bié)為88.3 g/L與0.61 g/g。

B，岩藻(zǎo)糖基(jī)化HMOs：3-FL細(xì)胞(bāo)工廠的構(gòu)建(jiàn) 

在(zài)E. coli中，通(tōng)過從(cóng)頭合成(chéng)途徑重構(gòu)，糖基轉移(yí)酶(méi)表(biǎo)達優化(huà)與(yǔ)分子(zǐ)改造(zào)，基於(yú)無(wú)膜細胞(bāo)器的途(tú)徑(jìng)酶(méi)組(zǔ)裝等策略(lüè)，3-FL的搖(yáo)瓶產(chǎn)量達到13.5 g/L。

C，岩藻(zǎo)糖(táng)基(jī)化(huà)HMOs：LNnT細(xì)胞(bāo)工(gōng)廠(chǎng)的構(gòu)建(jiàn)

以B. subtilis 168為底盤細(xì)胞(bāo)，通(tōng)過異(yì)源(yuán)途徑的組裝適配以及(jí)關鍵基因(yīn)的(dí)表達優化，實現(xiàn)了以(yǐ)葡萄糖和乳糖為底物(wù)的LNnT從頭合成(chéng)，產(chǎn)量為1.31 g/L 基(jī)於dCas9創製(zhì)了木糖(táng)誘導(dǎo)型的CRISPRi係(xì)統，對LNnT合(hé)成(chéng)的競(jìng)爭(zhēng)途(tú)徑進(jìn)行(háng)動(dòng)態組合弱化，LNnT搖瓶產量提(tí)升至2.30 g/L，3-L發酵罐(guàn)上產量達到(dào)5.4 g/L。

D，唾液酸(suān)化(huà)HMOs：3′-SL細胞工(gōng)廠的(dí)構(gòu)建(jiàn) 

通過(guò)係統的表(biǎo)征(zhēng)，設計與優(yōu)化，獲(huò)得代(dài)謝(xiè)途(tú)徑精(jīng)細調控工具-N端編碼序列(NCS)，並(bìng)利用(yòng)該(gāi)工具在B. subtilis中實現了(liǎo)3′-SL前體唾(tuò)液(yè)酸(suān)的從頭合(hé)成。經過一(yī)係列優化，最終3′-SL產量達(dá)到1252.1 mg/L。

劉(liú)龍教授團隊利用合成生物學技術(shù)設(shè)計(jì)構築了(liǎo)係(xì)列(liè)細胞工廠，從(cóng)而實(shí)現(xiàn)了(liǎo)乳鐵蛋白，母(mǔ)乳(rǔ)脂(zhī)質，HMOs等嬰配(pèi)奶(nǎi)粉(fěn)關鍵(jiàn)功能(néng)營養因(yīn)子的高(gāo)效合(hé)成，中試(shì)或(huò)工(gōng)業化生(shēng)產(chǎn)。

劉龍教授(shòu)詳細(xì)地(dì)介紹(shào)了他們(mén)團隊(duì)在(zài)構建(jiàn)細胞工程高效合成嬰配奶粉(fěn)關(guān)鍵(jiàn)功(gōng)能營養因子(zǐ)的研究工作，為進(jìn)一(yī)步(bù)促(cù)進(jìn)嬰(yīng)配奶(nǎi)粉(fěn)行業(yè)的(dí)高質量發展(zhǎn)具(jù)有重(zhòng)要意(yì)義。